Badamy różne mechanizmy kontroli translacji, które regulują produkcję określonych zestawów białek poprzez chemiczne modyfikacje cząsteczek tRNA. Każde białko w komórce jest produkowane przez rybosom, który wykorzystuje cząsteczki transferowego RNA (tRNA) do tłumaczenia informacji sekwencyjnej zakodowanej w mRNA na prawidłowo złożone łańcuchy polipeptydowe. Dekodowanie/translacja informacji genetycznej opiera się na rozpoznaniu odpowiedniego kodonu przez odpowiadający mu tryplet antykodonów tRNA.

Laboratorium skupia się na zrozumieniu mechanizmów molekularnych, które prowadzą do specyficznych modyfikacji zasad w antykodonach tRNA. Modyfikacje te mają silny wpływ na wydajność i dokładność parowania kodon-antykodon, a tym samym regulują tempo translacji i dynamikę składania syntezy białek. Ostatnie odkrycia wykazały, że zmiany w tych ścieżkach modyfikacji odgrywają ważną rolę w powstawaniu niektórych chorób neurodegeneracyjnych i nowotworów.

Krystalografia białek umożliwia nam wizualizację struktur białkowych na poziomie atomowym i zwiększa nasze zrozumienie funkcji białek. Krystalografia rentgenowska została po raz pierwszy zastosowana do makromolekuł biologicznych (np. hemoglobiny) pod koniec lat 50. i została nagrodzona Nagrodą Nobla w dziedzinie chemii w 1962 roku, co miało ogromny wpływ na dalszy rozwój biologii strukturalnej. Do określenia struktury potrzebny jest wysokiej jakości kryształ określonego białka. Uzyskanie takiego kryształu jest kluczowym etapem w krystalografii białek i zostało w pełni zautomatyzowane dzięki opracowaniu platform krystalizacyjnych, które przeprowadzają wysokoprzepustowe badania przesiewowe setek tysięcy warunków eksperymentalnych, co ułatwia optymalizację procesu krystalizacji. Aby zobaczyć białka w rozdzielczości atomowej i określić ich strukturę, musimy wykorzystać promieniowanie elektromagnetyczne dostarczane przez linie synchrotronowe. Ta zaawansowana technika opiera się na rozpraszaniu promieniowania rentgenowskiego na atomach cząsteczki, co daje wzór dyfrakcyjny, wykorzystywany do generowania mapy gęstości elektronowej i ostatecznie rozwiązania struktury białka.

W naszym laboratorium wykorzystujemy krystalografię rentgenowską do badania, jak białka oddziałują z innymi cząsteczkami (np. tRNA) oraz zdobywamy szczegółową wiedzę na temat zespołów wielkocząsteczkowych i ich roli w regulacji posttranskrypcyjnej. Niedawno uzyskaliśmy grant TEAM-TECH Core Facility z Fundacji na rzecz Nauki Polskiej na utworzenie Structural Biology Core Facility, wyposażonego w wysoce wyspecjalizowane urządzenia do prób krystalizacyjnych, aby zapewnić maksymalną wydajność i powtarzalność w procesie krystalizacji.

Modyfikacja tRNA jest złożoną dziedziną ze względu na fakt, że odkryto ponad 100 różnych rodzajów modyfikacji i ich zróżnicowaną rolę w utrzymaniu sztywności struktury tRNA i zapewnieniu wierności translacji podczas dekodowania w rybosomie. Przedmiotem naszego zainteresowania jest mediowana przez kompleks Elongator modyfikacja cm5 na urydynie 34 w pozycji wobble pętli antykodonowej tRNA. Brak tej modyfikacji wyłącza dalsze modyfikacje, takie jak mcm5, ncm5, mcm5s2, co zostało powiązane z plejotropowymi fenotypami na poziomie komórkowym, jak również w chorobach człowieka, w tym nowotworach, chorobach neurodegeneracyjnych i niepełnosprawności intelektualnej. Kompleks Elongator jest wysoce konserwatywny i składa się z 2 kopii 6 podjednostek (Elp1-6). Integralność kompleksu jest ściśle związana z jego funkcją. Ostatnio opisaliśmy strukturę EM kompleksu apo, jak również strukturę krystaliczną podjednostki katalitycznej (Elp3). Dzięki analizom biofizycznym i biochemicznym udało nam się wyjaśnić, w jaki sposób podjednostka katalityczna oddziałuje z substratem tRNA oraz jak inne podjednostki przyczyniają się do jej prawidłowego funkcjonowania.

Jednocząsteczkowa mikroskopia elektronowa (cryo-EM) jest metodą biologii strukturalnej stosowaną do rozwiązywania wysokorozdzielczych struktur białek i ich kompleksów. Dzięki postępowi w dziedzinie sprzętu i oprogramowania staje się ona coraz bardziej popularna. W porównaniu z krystalografią, gdzie wzrost kryształów stanowi poważne wąskie gardło w procesie rozwiązywania struktur, w krioEM cząsteczki białek są zamrażane w stanie ciekłym, przypominającym szklisty lód i obrazowane w mikroskopie elektronowym. Następnie cząstki są selekcjonowane i klasyfikowane w celu wygenerowania klas 2d. Następnie te 2d klasy są używane do odtworzenia map gęstości badanych cząstek, które mogą być dalej wykorzystane do budowy modeli.

W Max Planck Research Group wykorzystujemy krio-EM do badania 850 kDa eukariotycznego kompleksu Elongator odpowiedzialnego za początkową modyfikację wobble urydyny w pozycji C5 wybranych tRNA. Ponadto interesujemy się również tym, jak Elongator jest regulowany przez białka Kti11, Kti12, Kti13 i Kti14. Pracownia biologii strukturalnej w Małopolskim Centrum Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego wyposażona jest w JEOL HDT-400 glow discharger, FEI Vitrobot Mark IV oraz Molecular Dimensions grid box storage system, czyli wszystko co jest potrzebne do przygotowania i przechowywania próbek krioEM. Krio-siatki są prześwietlane na mikroskopie elektronowym JEOL JEM2100 HT CRYO LaB6 zainstalowanym w Zakładzie Biologii Komórki i Obrazowania w Instytucie Zoologii i Badań Biomedycznych UJ.

Zespół Cell Room powstał w ramach projektu First Team, którego celem było zbadanie roli kompleksu Elongator w komórkach ludzkich. Pracujemy głównie na komórkach HEK293, które są naszym źródłem ludzkiego tRNA i ludzkich białek zaangażowanych w proces modyfikacji tRNA. Nasze główne techniki to transfekcja i transdukcja lentiwirusowa w celu modulacji poziomu interesujących nas białek; WB, RT-PCR, fluorescencyjna mikroskopia konfokalna w celu weryfikacji poziomu białek i ich lokalizacji. Oprócz podstawowych testów fenotypowych (żywotność komórek, proliferacja komórek), wprowadziliśmy również analizę HPLC i specyficzne testy do ilościowej oceny poziomów zmodyfikowanych izoakceptorów tRNA oraz liczne testy funkcjonalne do monitorowania konsekwencji utraty funkcji Elongatora i/lub jego kofaktorów (odpowiedź na stres oksydacyjny, agregacja białek, migracja). Wreszcie, interesują nas interakcje pomiędzy ludzkimi białkami zaangażowanymi w proces modyfikacji tRNA (CoIP, BioID2 na białkach typu dzikiego lub zmutowanych nadekspresowanych w komórkach).